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技術(shù)資訊
Technical Information王繼鳳1 李芙燕1 陳耀星1 3 王子旭1 咼于明2
(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京100193 ; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,北京100193)
摘 要: 本試驗(yàn)通過(guò)日糧中添加丁酸鈉研究其對(duì)肉雞小腸黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞的影響。將32 只1 日齡健康A(chǔ)A 肉雞隨機(jī)分為4 個(gè)處理組:A 組(對(duì)照組:基礎(chǔ)日糧) 、B 組(丁酸鈉組:基礎(chǔ)日糧+ 500 mg/ kg 丁酸鈉) 、C 組(丁酸鈉+ 芽孢桿菌組:基礎(chǔ)日糧+ 100 mg/ kg 丁酸鈉+ 200 mg/ kg 芽孢桿菌) 和D 組(丁酸鈉+ 酶制劑組:基礎(chǔ)日糧+ 100 mg/ kg丁酸鈉+ 500 mg/ kg 酶制劑) 。試驗(yàn)7 周后,采用組織學(xué)技術(shù)研究肉雞小腸黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞的分布變化。結(jié)果顯示: (1) 與對(duì)照組比較,小腸肥大細(xì)胞、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及杯狀細(xì)胞的形態(tài)無(wú)明顯變化,肥大細(xì)胞多存在于腸腺周圍和腸絨毛固有層; (2) 各試驗(yàn)組的小腸肥大細(xì)胞、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及杯狀細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照組( P < 0.05) ; (3)各試驗(yàn)組和對(duì)照組小腸肥大細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)均從前向后逐漸減少,十二指腸的肥大細(xì)胞最多,空腸的次之,回腸的較少;杯狀細(xì)胞數(shù)則與之相反。由此可知,3 種添加劑可不同程度地改善肉雞小腸黏膜結(jié)構(gòu),且將丁酸鈉分別與芽孢桿菌和酶制劑混合飼喂,效果在一定程度上好于單獨(dú)飼喂丁酸鈉。
關(guān)鍵詞: 丁酸鈉;黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞;小腸;肉雞
短鏈脂肪酸(s hort chai n f at t y acid ,SCFA) 是由大腸內(nèi)厭氧菌通過(guò)發(fā)酵可溶性纖維產(chǎn)生的碳鏈為1～6 的有機(jī)酸。在短鏈脂肪酸中乙酸、丙酸和丁酸對(duì)人體代謝有重要作用。其中丁酸有水、脂兩親性,偏重于親脂。在p H 4～6 時(shí)不易被分解,所以部分可以避過(guò)酸性環(huán)境的小腸, 直接進(jìn)入盲腸和結(jié)腸。由于丁酸具有游離性和揮發(fā)性的特點(diǎn),所以在生產(chǎn)中一般將其制成相對(duì)穩(wěn)定的鈉鹽。在20 世紀(jì)80 年代初期國(guó)外學(xué)者就已經(jīng)觀察到短鏈脂肪酸鈉鹽影響瘤胃營(yíng)養(yǎng)代謝及其消化能力。丁酸鈉作為一種新型飼料添加劑, 對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,同時(shí)還可以為結(jié)腸提供能量物質(zhì)。另外在畜禽日糧中添加酸化劑丁酸鈉也可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善動(dòng)物腸道內(nèi)微生物區(qū)系以及調(diào)整動(dòng)物腸道菌群的生態(tài)平衡,提高其機(jī)體免疫力。但對(duì)于丁酸鈉作為一種新型飼料添加劑的研究主要集中于對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)和生產(chǎn)的影響, 而對(duì)小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)影響的研究比較薄弱。為此,本試驗(yàn)擬通過(guò)研究丁酸鈉及其與其他類飼料添加劑配伍后對(duì)肉雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響, 為科學(xué)使用這種飼料添加劑提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。
1、材料與方法
1. 1 試驗(yàn)動(dòng)物的分組與飼養(yǎng)
將32 只1 日齡健康A(chǔ)A 肉雞隨機(jī)分成4 個(gè)處理組,每組8 只:A 組(對(duì)照組:基礎(chǔ)日糧) 、B 組(丁酸鈉組:基礎(chǔ)日糧+ 500 mg/ kg 丁酸鈉) 、C 組(丁酸鈉+ 芽孢桿菌組:基礎(chǔ)日糧+ 100 mg/ kg 丁酸鈉+ 200 mg/ kg芽孢桿菌) 和D 組(丁酸鈉+ 酶制劑組:基礎(chǔ)日糧+100 mg/ kg 丁酸鈉+ 500 mg/ kg 酶制劑) 。開放式雞舍單籠飼養(yǎng),各組其他飼養(yǎng)管理方法完全一致,即按北京愛拔益加家禽育種有限公司提供的《肉用仔雞飼養(yǎng)管理手冊(cè)》進(jìn)行飼養(yǎng)管理,飼養(yǎng)期為7 周。
1. 2 取材
將肉雞放血處死, 剖開腹腔, 迅速取出十二指腸、空腸和回腸各5 cm 左右,用新配制的生理鹽水洗干凈,放入4 %多聚甲醛磷酸緩沖液(011 mol/ L ,p H 7.4) 中固定48 h 。
1. 3 染色與數(shù)據(jù)處理
1. 3. 1 甲苯胺蘭染色
石蠟包埋,連續(xù)橫斷切片, 厚6 μm 。在染色液(0.8 %甲苯胺蘭,0.6 %高錳酸鉀,蒸餾水煮沸配制)中浸染約30 s , 蒸餾水洗2 次后, 用90 %酒精分色(顯微鏡下控制) ,100 %酒精脫水,二甲苯透明,中性
樹脂封片。光鏡下觀察肥大細(xì)胞的形態(tài)及其分布,統(tǒng)計(jì)各段小腸橫斷面全層肥大細(xì)胞的數(shù)量。SAS8.2 軟件包(SAS Institute , 2001) 對(duì)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。
1. 3 . 2 HE 染色和PAS 染色
石蠟包埋, 連續(xù)橫斷切片, 厚6 μm , 進(jìn)行常規(guī)HE 染色和PAS 染色。光鏡下詳細(xì)觀察上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的形態(tài)及其分布, 在各段小腸每一橫切面中選取5 根柱狀細(xì)胞排列整齊的腸絨毛,統(tǒng)計(jì)每100 個(gè)柱狀細(xì)胞中散在分布的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量。應(yīng)用SAS 8. 2 軟件包(SAS Institute , 2001) 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。
2、結(jié)果
2. 1 各處理組小腸肥大細(xì)胞、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞分布與形態(tài)
2. 1 . 1 小腸肥大細(xì)胞
由圖1 可知,經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后,肥大細(xì)胞呈紫紅色; 形狀多樣,有圓形、橢圓形或梭形,大小不一。胞漿內(nèi)顆粒豐滿, 部分細(xì)胞呈脫顆粒狀。各試驗(yàn)組肥大細(xì)胞的形態(tài)未見明顯差異。各試驗(yàn)組小腸的肥大細(xì)胞多存在于腸腺周圍。小腸絨毛也有肥大細(xì)胞分布,但多位于固有層中,且按小腸絨毛底部、中部、頂部依次減少。少量肥大細(xì)胞分布于肌層和漿膜層,常見于小血管和小淋巴管周圍。
2. 1. 2 上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞
由圖1 可知,經(jīng)HE 染色后在光鏡下觀察,可見上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞散在分布于腸絨毛上皮細(xì)胞之間,多數(shù)位于上皮細(xì)胞基側(cè)膜附近。少量見于上皮核層和頂層。該細(xì)胞以小型細(xì)胞為主, 胞核大而圓, 深染,胞漿較少。杯狀細(xì)胞經(jīng)PAS 染色后呈紅色, 高腳杯狀,散在分布于上皮細(xì)胞間,不同的腸段杯狀細(xì)胞的數(shù)量也有所不同。
2. 2 小腸肥大細(xì)胞、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量
2. 2 . 1 小腸肥大細(xì)胞
由表1 可以看出,各試驗(yàn)組肥大細(xì)胞的數(shù)量存在差異,且均高于對(duì)照組( P < 0.05) 。在十二指腸,D 組的肥大細(xì)胞最多, 其次是C 組, 但2 組間差異不顯著( P > 0.05) ,B 組的肥大細(xì)胞數(shù)量少于C 組,但多于A 組, 并且3 組之間存在顯著差異( P <0.05) ;空腸D 組的肥大細(xì)胞最多,其次分別是C 、B組,D 組與C 、B 組間存在顯著差異( P < 0.05) ,但C和B 組間無(wú)顯著性差異( P > 0.05) ?；啬c的肥大細(xì)胞C 組最多,其次是B 和D 組,而C、B 和D 組之間無(wú)顯著性的差異,但C、B 和D 組與對(duì)照組間存在顯著性差異( P < 0.05) 。各處理組的肥大細(xì)胞數(shù)從十二指腸到回腸逐漸減少。
2. 2 . 2 上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞
表2 為各處理組小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化。在十二指腸中C 組的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)最多,D 組次之, 2 組間無(wú)顯著性差異( P > 0.05) ,B 組的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著少于D 組( P < 0.05) ,各試驗(yàn)組的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量都顯著多于對(duì)照組( P < 0.05) ;空腸的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量以D 組最多,其次是C 組, 2 組間存在顯著性差異( P <0.05) ,B 組的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著少于C 組( P < 0.05) ,3 個(gè)試驗(yàn)組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組( P < 0.05) ; 回腸以D 組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量最多,其次是B 組, 2 組間無(wú)顯著性差異( P >0.05) ,C 組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著少于D 組( P < 0.05) , 各試驗(yàn)組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組( P < 0.05) 。各試驗(yàn)組的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)從十二指腸到回腸遞減。
2. 2 . 3 上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞
表3 可以看出各處理組對(duì)上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響。在十二指腸中D 組的杯狀細(xì)胞數(shù)最多,其次是C 組,2 組間存在顯著性差異( P < 0.05) , C 組的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著多于B 組( P < 0.05) , 各試驗(yàn)組的杯狀細(xì)胞數(shù)量都顯著多于對(duì)照組( P < 0.05) ;在空腸中D 組的杯狀細(xì)胞數(shù)最多,B 組次之,2 組間存在顯著性差異( P < 0.05) , C 組的杯狀細(xì)胞數(shù)顯著少于B 組( P < 0.05) , 3 個(gè)試驗(yàn)組的杯狀細(xì)胞數(shù)量除C 組外都顯著多于對(duì)照組( P < 0.05) ; 回腸的杯狀細(xì)胞數(shù)量也是以D 組的最多,C 組較少,2 組間存在顯著性差異( P < 0.05) ,B 組的杯狀細(xì)胞顯著少于C 組( P < 0.05) ,各試驗(yàn)組的杯狀細(xì)胞都顯著多于對(duì)照組( P < 0.05) 。表3 反映出各組小腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量由十二指腸到回腸逐漸增加。
3、討論
3. 1 3 種飼料添加劑對(duì)肉雞小腸肥大細(xì)胞數(shù)量分布的影響
腸道不僅是消化、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的場(chǎng)所,而且具有重要的免疫功能。由于在腸道內(nèi)多種微生物形成菌叢,而腸道允許這些微生物共存的同時(shí),可以識(shí)別侵入的有害微生物以及被黏膜上皮吸收的異己物質(zhì),并加以排除,因而腸道黏膜免疫是機(jī)體防止感染的第一道防線。腸道黏膜屏障包括機(jī)械屏障和免疫學(xué)屏障等,主要由腸黏膜吸收上皮細(xì)胞和腸道相關(guān)淋巴細(xì)胞構(gòu)成。腸黏膜吸收上皮細(xì)胞除了具有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收功能外, 在調(diào)節(jié)機(jī)體天然和獲得性免疫中也具有重要的作用。腸道相關(guān)淋巴細(xì)胞包括肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等,其中肥大細(xì)胞是天然免疫的效應(yīng)細(xì)胞之一, 不僅在天然免疫中發(fā)揮重要作用,是機(jī)體抗感染免疫的第一線細(xì)胞,而且能通過(guò)所分泌的細(xì)胞因子參與獲得性免疫,所以肥大細(xì)胞是重要的免疫活性細(xì)胞。有報(bào)道指出腸道中的肥大細(xì)胞對(duì)腸道疾病有一定的防御作用, 腸道黏膜上皮首先對(duì)入侵的細(xì)菌發(fā)生反應(yīng), 從而激活鄰近的肥大細(xì)胞產(chǎn)生放大效應(yīng)。本試驗(yàn)在飼料中加入不同的添加劑后,發(fā)現(xiàn)不同程度地促進(jìn)肉雞小腸肥大細(xì)胞的數(shù)量增加, 而丁酸鈉和酶制劑組肥大細(xì)胞的數(shù)量增加最多, 作用略強(qiáng)于丁酸鈉和芽孢桿菌組, 但這兩組增加的肥大細(xì)胞數(shù)量都多于丁酸鈉組, 這說(shuō)明將丁酸鈉分別與芽孢桿菌和酶制劑混合使用, 能更好的維護(hù)機(jī)體的免疫功能,防止機(jī)體受到病原菌的侵害,從而有利于機(jī)體的生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明各處理組的肥大細(xì)胞從十二指腸到回腸遞減, 有試驗(yàn)表明在小鼠消化道中空腸的肥大細(xì)胞數(shù)量也多于回腸的肥大細(xì)胞數(shù)量,與本研究結(jié)果類似。但是, 肥大細(xì)胞這種分布特點(diǎn)的生理意義還有待于進(jìn)一步研究。
3. 2 3 種飼料添加劑對(duì)肉雞小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量分布的影響
腸道相關(guān)淋巴組織分為組織性淋巴樣組織及散在于整個(gè)腸壁中的淋巴細(xì)胞。上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是黏膜免疫系統(tǒng)中最先接觸抗原的免疫活性細(xì)胞, 在腸道黏膜中起重要的免疫屏障作用。本試驗(yàn)的結(jié)果表明將丁酸鈉和酶制劑混合加入飼料中會(huì)使上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量明顯的增多, 而且效果好于丁酸鈉和芽孢桿菌的混合作用, 但是這兩組間在空腸和回腸中的作用有一定的差異, 這可能是因?yàn)槊钢苿┲饕诳漳c和回腸發(fā)揮作用。本研究結(jié)果表明各組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞從十二指腸到回腸逐漸減少, 這一分布特點(diǎn)和已有的報(bào)道一致 。
3. 3 3 種飼料添加劑對(duì)肉雞小腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量分布的影響
在吸收細(xì)胞中還夾雜有杯狀細(xì)胞, 杯狀細(xì)胞的主要功能是分泌黏蛋白,黏蛋白是一種糖蛋白,釋入管腔內(nèi)成為潤(rùn)滑性黏液涂布于上皮表面, 對(duì)上皮具有保護(hù)作用。杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白和柱細(xì)胞分泌的復(fù)合糖蛋白組成了腸道黏膜上皮細(xì)胞表面的細(xì)胞衣,而且細(xì)胞衣的糖蛋白和細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)結(jié)合牢固,可捕獲微生物,是潛在致病原的重要物理屏障。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在飼料中添加丁酸鈉和酶制劑會(huì)使上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞的數(shù)量顯著增多, 而且效果要好于丁酸鈉和芽孢桿菌的混合使用, 但是將丁酸鈉分別與酶制劑和芽孢桿菌混合使用,效果都好于單獨(dú)使用丁酸鈉。試驗(yàn)結(jié)果表明各處理組的杯狀細(xì)胞由十二指腸到回腸逐漸遞增, 細(xì)胞衣增厚,可以更好發(fā)揮其潛在的物理屏障, 從而避免機(jī)體受到外界病原微生物的侵害。這表明這幾種添加劑提高了機(jī)體的免疫能力, 有利于機(jī)體的生長(zhǎng)。Clausen 等研究表明腸道內(nèi)丁酸鹽濃度降低是結(jié)腸息肉和結(jié)腸癌發(fā)病率高的原因之一。也有研究表明丁酸鈉可以減緩結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。這些研究說(shuō)明丁酸鈉對(duì)動(dòng)物免疫水平具有一定的作用, 而本研究中的數(shù)據(jù)表明在飼料中添加丁酸鈉可以顯著增加肥大細(xì)胞、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量, 這也說(shuō)明丁酸鈉可以提高動(dòng)物的腸黏膜免疫功能, 增強(qiáng)黏膜的屏障功能。有研究表明芽孢桿菌是一種益生素,它能在數(shù)量上補(bǔ)充腸道內(nèi)缺乏的正常微生物,調(diào)整、維持體內(nèi)生態(tài)平衡,從而增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能,提高飼料轉(zhuǎn)化率,達(dá)到防病治病,提高畜禽生產(chǎn)性能的目的。酶制劑則含有多種消化酶, 能有效促進(jìn)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收, 減少營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩性腹瀉的發(fā)生。這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。
4、結(jié)論
通過(guò)本試驗(yàn)在飼料中添加500 mg/ kg 的丁酸鈉、200 mg/ kg 芽孢桿菌和500 mg/ kg 酶制劑后, 可增加肉雞小腸肥大細(xì)胞、杯狀細(xì)胞及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量, 但丁酸鈉分別與芽孢桿菌和酶制劑混合飼喂, 效果在一定程度上好于單獨(dú)飼喂丁酸鈉。
